Quando o LongTR ou o HipSTR são utilizados para genotipagem de STR, os números dos alelos derivados da saída por vezes diferem daqueles encontrados em bancos de dados de referência, perfis baseados em CE ou outras ferramentas forenses. Um alelo do D2S441 que deveria ser reportado como 11.3 pode aparecer como 11.8 quando seu comprimento em pares de bases é convertido em repetições dividindo pelo comprimento do motivo, por exemplo em uma planilha como o Excel formatada com uma casa decimal. Nenhum erro é gerado. O software funcionou corretamente. A discrepância é consequência de duas convenções de nomenclatura incompatíveis aplicadas à mesma sequência subjacente e pode ser resolvida com uma simples conversão aritmética.

O que é o campo GB?

O LongTR e o HipSTR não armazenam os números de alelos diretamente no VCF. Em vez disso, eles registram o número de pares de bases pelo qual cada alelo difere da sequência de referência naquele locus. Esse valor é armazenado em um campo chamado GB, abreviação de GenotypingBases.

Uma linha de saída real do VCF se parece com isto:

4|1:-1|8:1.00:0.50:16:0:0:0|0:0|0:28.03:-2|1;-1|5;8|8;9|1;12|1:-1|6;8|10

Nesta linha o GB é o segundo campo, logo depois do GT: -1|8. A coluna FORMAT indica a ordem dos campos, então convém ler ali a posição do GB em vez de supô-la.

O símbolo de barra vertical separa os dois alelos:

-1 significa que o alelo 1 é 1 par de bases mais curto que a referência
+8 significa que o alelo 2 é 8 pares de bases mais longo que a referência

Cada número de alelo no genótipo final é derivado desses dois valores, juntamente com as informações de referência no arquivo BED usado durante a genotipagem.

O campo GB em uma linha de saída VCF do LongTR / HipSTR

Para D2S441 no hg38, os valores relevantes do arquivo BED são:

ref_repeats = 12 (a referência contém 12 unidades de repetição completas; sua designação CE também é 12)
period = 4 pb (o motivo é TCTA, com quatro bases de comprimento)
Tamanho de referência = 12 × 4 = 48 pb

Analisando o cálculo

Seguindo o alelo 1 (GB = -1) passo a passo:

Passo 1. Total de pares de bases deste alelo:

Referência: 12 repetições × 4 pb = 48 pb GB = -1 Total do alelo 1 = 48 - 1 = 47 pb

Passo 2. É aqui que uma conversão por divisão e o ISFG divergem.

Dividindo o total de pares de bases pelo comprimento do motivo e arredondando para uma casa decimal, obtém-se:

47 ÷ 4 = 11,75 → arredondado: 11,8

O VCF do LongTR e do HipSTR não contém esse decimal: o GB é um inteiro (aqui, -1). O 11,8 vem de uma etapa de conversão como esta, por exemplo uma planilha como o Excel que mostra 11,75 com uma casa decimal, não do VCF.

A convenção do ISFG faz uma pergunta diferente: quantas unidades de repetição completas cabem em 47 pb e quantas bases sobram?

47 pb = 11 repetições completas de TCTA (44 pb) + 3 bases extras Notação ISFG: 11.3

Ambos os valores descrevem a mesma sequência física de 47 pares de bases. A diferença reside inteiramente na forma como o componente parcial é expresso: a divisão dá uma fração decimal arredondada de uma unidade de repetição, enquanto o ISFG reporta diretamente a contagem de bases extras.

De 47 pb ao alelo 11.3: dividir pelo comprimento do motivo versus a contagem do ISFG

O alelo 2 não requer correção: GB = +8 → 48 + 8 = 56 pb → 56 ÷ 4 = 14,0 → sem repetição parcial → ISFG: 14.

Por que isso é importante

Bancos de dados forenses de população, incluindo dados de referência do CODIS, tabelas de frequência do ESS e estudos populacionais publicados, utilizam exclusivamente a notação ISFG. Um alelo designado como 11.8 não aparece em nenhum desses recursos. O envio de um alelo convertido dessa forma sem corrigi-lo não retornará nenhuma correspondência no banco de dados e não produzirá nenhuma mensagem de erro. A discrepância é silenciosa e, se não for detectada, afetará os cálculos da razão de verossimilhança e as comparações de perfis entre plataformas.

O mesmo problema surge ao validar resultados de leitura longa contra perfis baseados em CE do mesmo indivíduo ou contra amostras de referência conhecidas.

A regra de conversão

Se você encontrar decimais que vêm de dividir pelo comprimento do motivo, esta tabela os traduz em bases extras para loci de tetranucleotídeos. Ela só traduz o decimal. O número do alelo precisa partir da designação CE do alelo de referência para esse locus, montagem e janela (para o D2S441 no hg38, CE 12). Em outros loci, indels flanqueadores ou convenções históricas de comprimento podem fazer a conta diferir, então não é um algoritmo geral.

Decimal (÷ 4, arredondado)	Bases extras	Sufixo ISFG
,3	1	.1
,5	2	.2
,8	3	.3

O padrão se mantém porque a divisão calcula as bases extras ÷ período e arredonda. Para um locus de tetranucleotídeo, 3 bases extras resultam em 3 ÷ 4 = 0,75, que é arredondado para 0,8. O ISFG registra a mesma situação como .3, contando as bases extras diretamente.

Loci afetados confirmados ao usar o arquivo BED padrão HipSTR hg38:

0,8 → ISFG .3: D1S1656, D2S441, D6S1043, D12S391, TH01

0,5 → ISFG .2: D18S51, D19S433, D21S11, FGA

Resumo

O LongTR e o HipSTR codificam a informação dos alelos como uma diferença em pares de bases em relação à sequência de referência, armazenada no campo GB do VCF. Aplicando essa diferença ao tamanho de referência obtém-se o comprimento do alelo em pares de bases. Dividir esse comprimento pelo comprimento do motivo dá um decimal que, arredondado, não é uma designação ISFG. A notação ISFG conta as unidades de repetição completas e as bases extras que sobram, partindo da designação CE do alelo de referência do locus. Para loci de tetranucleotídeos, um 0,8 arredondado corresponde a 3 bases extras, que o ISFG escreve como .3. A conversão deve ser aplicada antes de qualquer consulta a banco de dados, cálculo de razão de verossimilhança ou comparação de perfis entre plataformas.

Referências

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