Os alelos STRs são tradicionalmente definidos pelo comprimento do fragmento utilizando eletroforese capilar (CE). Essa abordagem tem sido a base da análise forense de DNA por décadas. Compreender o que muda ao passar de uma tipagem baseada em comprimento para uma baseada em sequência é essencial para interpretar dados forenses modernos.

O modelo baseado em comprimento (CE)

Na tipagem de STRs por CE, os alelos são atribuídos com base no tamanho dos fragmentos de DNA amplificados. O comprimento do fragmento reflete o número de unidades repetidas presentes, e os números de alelo são inferidos a partir dele com uma convenção de comprimento calibrada para cada locus por meio de escadas alélicas.

CE mede comprimento de fragmento, não sequência.

Esse modelo é robusto, padronizado e altamente reprodutível entre laboratórios. Para a rotina forense, continua sendo o padrão operacional.

O limite de resolução do comprimento

Diferentes sequências de DNA podem gerar fragmentos com o mesmo comprimento. Esses casos são chamados de isoalelos; alelos que compartilham a mesma designação em CE, mas diferem ao nível de sequência.

Exemplo:

[ATCT]₁₄ — 14 repetições perfeitas
[ATCT]₁₂[ATCG]₁[ATCT]₁ — variação interna de sequência

Ambos são reportados como alelo 14 em CE. Isso não é uma limitação da sensibilidade do instrumento, mas sim uma restrição estrutural da tipagem baseada em tamanho. Mesmo comprimento não implica mesma sequência.

O modelo baseado em sequência (NGS/MPS)

A sequenciação de nova geração (NGS), também conhecida como sequenciação massivamente paralela (MPS), lê diretamente a sequência nucleotídica de cada alelo STR. Em vez de inferir o tamanho do alelo, o NGS captura a estrutura das repetições, variações internas e o contexto das regiões flanqueadoras.

NGS mede sequência, não apenas comprimento.

Como resultado, alelos que parecem idênticos em CE podem ser diferenciados ao nível de sequência.

Mesmo alelo, sequência diferente: resolução de isoalelos por CE vs NGS em um locus STR

O que a resolução de sequência acrescenta

A transição de comprimento para sequência traz quatro consequências diretas para a análise forense de STRs:

Isoalelos tornam-se distinguíveis. Alelos que em CE são agrupados em uma única designação passam a ser resolvidos em variantes de sequência distintas. Cada variante é contada e reportada separadamente.

Aumenta o poder de discriminação. Um maior número de alelos distintos por locus reduz a probabilidade de coincidência aleatória. Estudos publicados mostram consistentemente aumento no número efetivo de alelos quando dados de sequência substituem dados de tamanho em loci forenses.

Melhora a interpretação de misturas. Contribuintes que compartilham o mesmo alelo em CE podem apresentar sequências repetidas diferentes. O NGS os separa em alelos distintos, fornecendo informação adicional para a deconvolução de misturas.

Microvariantes são totalmente caracterizadas. O CE detecta microvariantes pelo tamanho (por exemplo, identifica um alelo 9.2), mas não determina quais bases compõem a repetição parcial. O NGS fornece a sequência completa, permitindo caracterização precisa e reprodutível.

Quando a resolução de sequência é relevante

Em muitos casos de fonte única, o CE fornece resolução suficiente. A informação ao nível de sequência torna-se crítica em contextos específicos:

Misturas complexas com dois ou mais contribuintes
Casos onde é necessário maximizar o poder de discriminação
Estudos populacionais que exigem diversidade alélica ao nível de sequência
Contextos de pesquisa onde a frequência de isoalelos impacta modelos estatísticos

Por que o CE continua sendo o padrão

O CE permanece como a tecnologia dominante em laboratórios forenses por razões bem estabelecidas: é rápido, custo-efetivo, apoiado por décadas de bancos de dados populacionais e regido por diretrizes harmonizadas internacionalmente. A transição para NGS não torna o CE obsoleto; define quando cada tecnologia deve ser utilizada.

Barreiras para adoção do NGS

Apesar das vantagens analíticas, o NGS introduz desafios que explicam sua adoção limitada na rotina:

Exigência bioinformática. As leituras brutas precisam ser filtradas, alinhadas a um genoma de referência e processadas por softwares específicos antes da chamada de alelos. Isso exige infraestrutura e expertise ainda não comuns na maioria dos laboratórios forenses.

Carga de validação. A implementação do NGS sob padrões forenses exige validações extensivas: limiares de sensibilidade, caracterização de stutter ao nível de sequência, diretrizes para interpretação de misturas e concordância com bancos de dados baseados em CE.

Padrões ainda em adoção. O CE se beneficia de décadas de padronização. Para os alelos STR por sequência, o ISFG publicou recomendações de nomenclatura em 2024 (Gettings et al.), mas sua implementação e harmonização entre kits, software e bancos de dados ainda estão em andamento.

Custo e throughput. Para análises rotineiras de alto volume, o CE ainda é mais rápido e mais barato por amostra.

O NGS adiciona resolução, mas também complexidade. Ambas devem ser avaliadas conforme a pergunta analítica.

Comparação direta

Critério	CE	NGS / MPS
Saída	Comprimento do fragmento	Sequência nucleotídica
Resolução de isoalelos	Não	Sim
Caracterização de microvariantes	Apenas tamanho	Sequência completa
Resolução de misturas	Baseada em tamanho	Ao nível de sequência
Bioinformática necessária	Mínima	Substancial
Throughput (rotina)	Alto	Menor (em lote)
Padronização	Estabelecida	Recomendações ISFG 2024; adoção em andamento
Bancos de dados populacionais	Extensos	Limitados, em crescimento

Resumo

CE e NGS não são tecnologias concorrentes; operam em níveis diferentes de resolução e atendem a necessidades distintas.
Quando o comprimento é suficiente, o CE é a ferramenta adequada. Quando a resolução ao nível de sequência altera o resultado, o NGS fornece informação que o CE estruturalmente não pode.
A questão não é qual tecnologia é melhor, mas qual nível de resolução o caso exige.

Referências

Gettings KB, Bodner M, Borsuk LA, King JL, Ballard D, Parson W et al. (2024). Recommendations of the DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics (ISFG) on short tandem repeat sequence nomenclature. Forensic Science International: Genetics, 68, 102946. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2023.102946